糖基化的新角色：如何在子宫内膜中为胚胎着床铺路？

【研究背景】

胚胎植入是怀孕的关键步骤，发生在子宫内膜处于“植入窗口期”时，此时子宫内膜对胚胎具有最高的接受性。这一过程受卵巢类固醇激素（雌二醇和孕酮）的调控。然而，不孕问题影响了众多夫妇，尽管体外受精-胚胎移植技术已经发展，但成功率仍然只有大约30%，失败的原因主要与胚胎植入有关。因此，深入理解胚胎植入的分子机制对于提高不孕治疗的成功率至关重要。糖基化作为蛋白质的一种重要翻译后修饰，其在细胞间相互作用中发挥关键作用，尤其是在胚胎植入过程中，特定的糖链结构可能与胚胎与子宫内膜的相互识别和附着密切相关。

【研究结果】

1. STs和FUTs在人月经周期子宫内膜中的表达

为了阐明人子宫内膜中STs和FUTs基因家族在月经周期中的变化，从基因表达综合库（GEO）下载的两个独立的微阵列数据集（GSE4888和GSE6364）。GSE4888含有增殖期（PE）、早期分泌期（ESE）、中期分泌期（MSE）和晚期分泌期（LSE）子宫内膜。GSE6364含有PE、ESE和MSE子宫内膜。对两个数据集的分析一致地显示，8个糖极化相关基因（FUT2、FUT4、FUT8、ST3GAL1、ST3GAL6、ST6GAL1、ST6GAL2、ST6GALNAC1）在整个月经周期中发生变化。与PE相比，MSE中FUT2、FUT4、ST3GAL1、ST3GAL6、ST6GAL1和ST6GALNAC1显著增加，而与PE相比，MSE中FUT8和ST6GAL2显著降低。

为了进一步明确这些糖基化基因在人类子宫内膜组织中的表达情况，我们从GSO数据库下载GSE111976数据集（scRNA-Seq），展示了七种子宫内膜细胞类型。显示了上皮细胞（CDH1和EPCAM）、基质成纤维细胞（COL1A1和COL3A1）和内皮细胞（PECAM1和CD34）的代表性生物标志物。结果显示FUT2、ST3GAL6和ST6GALNAC1在子宫内膜上皮中高度表达。本研究主要关注上皮细胞与胚胎的贴壁，并对ST6GALNAC1是否调控分泌期子宫上皮细胞的接受功能进行了研究。

2. ST6GALNAC1和sTn在人子宫内膜中的表达

为了验证生物信息学分析结果，进行免疫组织化学染色检测人子宫内膜组织中的ST6GALNAC1表达，主要定位于人子宫内膜的腔上皮（LE）和腺上皮（GE）中。我们还发现sTn在分泌期的人子宫内膜的LE和GE中深度浓缩。同时，定量分析结果显示分泌期子宫内膜中ST6GALNAC1和sTn水平显著高于增殖期。

通过一系列实验揭示了P4在人子宫内膜细胞中通过PR-A上调ST6GALNAC1表达的机制。首先，通过模拟月经周期中增殖期（E2，雌二醇）和分泌期（E2+P4，P4即孕酮）的内部环境，发现E2单独处理对ST6GALNAC1转录物水平无显著影响，而E2联合P4处理显著上调其表达。接着，通过构建PR-A和PR-B质粒并转染细胞，发现只有PR-A转染的细胞在P4处理后ST6GALNAC1转录物水平显著增加，表明PR-A参与调控ST6GALNAC1表达。进一步通过siRNA验证，发现PR siRNA显著减弱P4/PR-A介导的ST6GALNAC1表达，而PR-B siRNA无影响，进一步证实PR-A的作用。最后，通过ChIP实验，发现P4处理后PR与ST6GALNAC1启动子中的PRE结合，启动其表达。综上所述，这些实验结果表明P4通过PR-A直接调控ST6GALNAC1在人子宫内膜细胞中的表达。

3. ST6GALNAC1过表达升高sTn促进AN3CA细胞的感受性

进一步探讨ST6GALNAC1过表达对AN3CA细胞感受性的影响。首先，利用慢病毒介导的ST6GALNAC1过表达细胞（LV-ST6OE），发现与对照组（LV-NC）相比，LV-ST6OE细胞中sTn水平升高。接着，通过体外植入模型实验，发现LV-ST6OE细胞对JAR-球状体的接受潜力比载体转染细胞增加了2.5倍。进一步实验中，用特异性抗体阻断LV-ST6OE细胞中的sTn，发现这种增强的感受性显著减弱，而载体组中sTn抗体处理未见显著变化，可能与AN3CA细胞中sTn含量低有关。综上所述，这些实验结果表明，ST6GALNAC1过表达通过升高sTn水平，显著增强了AN3CA细胞对JAR-球状体的接受潜力。

4. 人子宫内膜细胞sTn修饰糖蛋白的鉴定

为了揭示ST6GALNAC1在人子宫内膜细胞中通过sTn修饰整合素b1和CD44，进而影响上皮-胚胎附着的机制。首先，通过免疫沉淀（IP）和LC-MS/MS分析，从ST6GALNAC1过表达的AN3CA细胞中鉴定出60种蛋白质，其中18种为分泌蛋白或细胞膜蛋白。重点关注了两种粘附分子——整合素b1和CD44，因为它们对上皮-胚胎相互作用至关重要且已被报告为sTn携带者。接着，通过qPCR和Western blot验证发现，ST6GALNAC1过表达显著下调整合素b1的转录和蛋白水平，而对CD44的转录和蛋白水平无显著影响。然而，免疫沉淀和反向IP实验显示，ST6GALNAC1过表达显著增加了整合素b1和CD44的sTn修饰水平。此外，微阵列数据分析表明，CD44在窗口期（WOI）的表达显著增强，而整合素b1的表达直到分泌晚期才发生变化。综上所述，这些实验结果表明ST6GALNAC1通过sTn修饰整合素b1和CD44，可能在上皮-胚胎粘附过程中发挥重要作用，其中sTn修饰的CD44可能在窗口期对上皮-胚胎粘附尤为重要。

5. 子宫内膜sTn修饰的CD44与滋养层细胞Siglec-6结合

深入探讨滋养层细胞中Siglec-6与子宫内膜sTn修饰的CD44之间的相互作用及其在胚胎着床中的作用。首先，通过分析已发表的单细胞RNA测序（scRNA-Seq）数据集，发现SIGLEC6在极性滋养外胚层（pTE）细胞中与多个标志物基因（如CCR7、CYP19A1和DLX5）共表达，这些细胞负责与子宫内膜上皮直接接触。进一步的细胞命运轨迹分析也显示SIGLEC6在滋养外胚层（TE）中表达。接着，利用永生化的正常人滋养层HTR-8/SVneo细胞模型，通过慢病毒系统过表达Siglec-6，并验证其转录和蛋白水平的表达。体外植入实验表明，Siglec-6过表达的滋养层细胞球状体对ST6GALNAC1过表达的子宫内膜细胞单层的粘附率显著增加。最后，通过蛋白质-蛋白质相互作用下拉实验，发现Siglec-6能够特异性结合子宫内膜中sTn修饰的CD44。综上所述，这些实验结果表明滋养层细胞中的Siglec-6可能通过与子宫内膜sTn修饰的CD44相互作用，在胚胎着床过程中发挥重要作用。

6. sTn/Siglec-G轴与小鼠胚胎着床

为了进一步验证了sTn/Siglec-G轴在小鼠胚胎着床中的作用。本研究通过一系列体内和体外实验，首先，通过收集非妊娠（NP）和妊娠第4天（GD4）的小鼠子宫内膜，发现与NP组相比，GD4组中ST6GALNAC1和sTn水平显著上调。接着，建立小鼠上皮子宫内膜类器官（EEO），发现E2上调Lcn2和Ltf的表达，E2加P4上调Sox17和ST6GALNAC1的表达，表明P4驱动ST6GALNAC1在鼠子宫内膜上皮细胞中的表达。免疫荧光染色显示，ST6GALNAC1和sTn在GD4时在腔上皮上高度表达。进一步实验中，在GD2将ST6GALNAC1 siRNA注射到小鼠子宫角中，发现ST6GALNAC1的敲低显著损害胚胎植入。同样，在GD3将抗sTn抗体注射到鼠子宫角中，发现阻断sTn显著抑制小鼠胚胎着床。鉴于小鼠不表达Siglec-6，通过公共数据库分析发现Siglec1、Siglecf和Siglecf在小鼠胚胎中表达，其中Siglecf在E3.5时表达水平较高。实验显示，Siglec-G在E3.5的小鼠胚胎中表达，且注射抗Siglec-G抗体显著抑制小鼠胚胎植入。最后，通过免疫沉淀和蛋白质相互作用测定，证实GD4时子宫内膜组织中的CD44含有sTn结构，并且CD44与重组小鼠Siglec-G相互作用，抗Tn抗体可抑制这种相互作用。综上所述，这些实验结果表明sTn/Siglec-G轴在小鼠胚胎着床中发挥重要作用，为理解胚胎-子宫内膜相互作用提供了新的机制见解。

【研究结论】

ST6GALNAC1通过调节子宫内膜中sTn的修饰，特别是在CD44上，促进了胚胎与子宫内膜的附着。人类的Siglec-6和小鼠的Siglec-G在胚胎滋养层中表达，并与sTn修饰的CD44结合，从而促进胚胎附着。这一发现揭示了胚胎植入过程中一个新的糖基化依赖机制，不仅增进了我们对糖基化生物学的理解，还为生殖医学中的诊断和治疗策略提供了新的可能性。

Dong X, Wang H, Cai J, Wang Y, Chai D, Sun Z, Chen J, Li M, Xiao T, Shan C, Zhang JV, Yu M. ST6GALNAC1-mediated sialylation in uterine endometrial epithelium facilitates the epithelium-embryo attachment. J Adv Res. 2025 Jun;72:197-212. doi: 10.1016/j.jare.2024.07.021. Epub 2024 Aug 5. PMID: 39111624.